«Разработка генной сети предрасположенности к онкопатологии на основе семейного анализа по генам клеточного цикла»

Мутации в основном происходят в двух классах генов: протоонкогены и гены-супрессоры опухолей. Функции генов-супрессоров при канцерогенезе утрачиваются, а у онкогенов - усиливаются. А в результате мутаций эти два класса генов способствуют возникновению онкопатологии за счет стимуляции клеточного деления, ингибирования клеточной смерти или остановки клеточного цикла, что приводит к стремительному увеличению количества опухолевых клеток (Carrassa L., 2010).

В связи с этим, изучение молекулярных механизмов, регулирующих прогрессию клеточного цикла, а также функциональное изменение в злокачественных клетках имеет решающее значение для более точного определения событий, лежащих в основе такого сложного и многофакторного заболевания, как рак (Kastan, 2004).

Цель исследования заключается в анализе взаимодействия и наследования генов клеточного цикла для разработки генной сети предрасположенности к онкологическим заболеваниям.

Исходя из цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести генотипирование полиморфных локусов rs2072052 гена CDK4, rs3087335 гена CDK2, rs137853294 гена Rb1, rs 121909250 гена ING1, rs3134613 гена Myc-L в семьях с различным онкологичным анамнезом;

2. Провести сравнительный анализ сочетаний генотипов;

3. Определить тип межгенных взаимодействий полиморфных локусов генов CDK4, CDK2, Rb1, ING1, Myc-L;

4. Провести анализ наследования аллелей генов CDK4, CDK2, Rb1, ING1, Myc-L в семьях с различным онкологическим анамнезом;

5. Провести моделирование генной сети предрасположенности к онкологическим заболеваниям на основе результатов исследования с использованием биоинформатических методов;

6. Разработать методические рекомендации по уроку.

Научная новизна: впервые проведены анализ наследования, анализ межгенных взаимодействий широкого спектра генов регуляции клеточного цикла, в результате чего были выявлены сочетания мутантных аллелей пяти генов (CDK4, CDK2, Rb1, ING1, Myc-L), приводящие к пролиферации клеток. Проведен сравнительный анализ трех биоинформатических online ресурсов моделирования генных сетей для сопоставления с результатами данного исследования.

Теоритическая и практическая значимость исследования: полученные данные вносят вклад в понимание роли мутаций в генах- онкосупрессорах и онкогенах и играют важную роль в практической деятельности для использования при расчете индивидуального риска развития онкопатологии и разработке подходов персонифицированной медицины. Выявленные сочетания непротективных аллелей генов CDK4, CDK2, Rb1, ING1, Myc-L могут использоваться в качестве маркеров предиктивной диагностики риска развития онкологических заболеваний.

Материалы работы могут быть использованы при изучении студентами особенностей регуляции клеточного цикла.

Апробация.

По результатам научного исследования будет опубликована статья «Исследование предрасположенности к онкопатологии на основе семейного анализа по генам клеточного цикла» в журнале «Вестник науки и образования», №7 (43), «Проблемы науки» - 2018 (согласно справке о принятии статьи к публикации №ВНО-2886 от 25.06.2018).

Также опубликована научная статья «Молекулярно-генетическое исследование особенностей регуляции уровня IL1B» (авторы: Г.Ф.Галикеева, к.б.н., ст.преподаватель кафедры генетики БГПУ им. М.Акмуллы, г.Уфа, Э.И.Кагирова, У.С.Самойлова) в международном сборнике научных статей XVI Международной научно-практической конференции «НАУКА И ОБРАЗОВАНИЕ: СОХРАНЯЯ ПРОШЛОЕ, СОЗДАЁМ БУДУЩЕЕ» - Пенза: МЦНС «Наука и Просвещение». – 2018. – Часть 1. - с. 25-27.

Работа выполнена в Центре молекулярно-генетических исследований при кафедре генетики естественно-географического факультета Башкирского государственного педагогического университета им. М.Акмуллы. Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю к.б.н., ст.преподавателю кафедры генетики Галикеевой Гузель Фанилевне, за неоценимую помощь в организации исследований и интерпретации результатов, д.б.н., профессору, заведующему кафедрой генетики Горбуновой Валентине Юрьевне за предоставленную мне возможность работать в данном научном учреждении. Сотрудникам кафедры генетики БГПУ им. М. Акмуллы за участие в обсуждении результатов и помощь в оформлении работы.

Сохранение геномной целостности является предпосылкой для безопасной и продолжительной жизни и предотвращает развитие заболеваний, связанных с геномной нестабильностью, таких как рак. ДНК постоянно испытывает действие большого числа химических и физических агентов, из-за чего, в клетках активизируется целый ряд механизмов, контролирующие целостность ДНК и стабильное прохождение клеточного цикла. При обнаружении любого типа повреждения ДНК происходит активация контрольно-пропускных пунктов клеточного цикла, репарации ДНК, апоптоза и транскрипции. Таким образом, нарушения контроля сверочных точек клеточного цикла, повреждения ДНК, изменение функций и мутации ключевых генов играют важную роль в патогенезе злокачественных опухолей (Poehlmann , 2010; Vermeulen и др., 2003 ; Aarts и др 2013; Kastan, 2004).

Согласно статистическим данным, в России в течение нескольких лет отмечается рост заболевания раком 6 основных органов (молочной железы, желудка, легких, прямой кишки, шейки матки и простаты) в 1,5 раза, а также возрастает смертность от онкопатологии (50% гибнет), одной из причин которых является позднее выявление онкологических заболеваний (Аксель, 2012).

На нынешний день нам уже известно более 100 белков и их генов, генетические нарушения которых приводят к росту злокачественных новообразований. Все они участвуют в генетической регуляции клеточного цикла (Кузнецова c cоавт., 2012).

В процессе подготовки клетки к делению и образования в дальнейшем из нее двух новых клеток отмечается несколько фаз: G1 фаза, в которой происходит подготовка к синтезу ДНК; S фаза - это период репликации ДНК; G2 фаза – подготовка к митозу; и митоз – процесс разделения клетки на 2 новые. Образовавшиеся дочерние клетки могут сразу же войти в новый цикл митоза, или на некоторое время выйти из него в стадию покоя – G0 фазу. Двигателем клеточного цикла является активация последовательно меняющихся друг за другом циклинзависимых киназ (рис.1). Каждая из циклинзависмых киназ представляет собой небелковый компонент связанный с белком. Этот комплекс состоит из каталитической субъединицы (Cdk) и регуляторной субединицы (циклин). Связывание с циклином увеличивает киназную активность cdk и определяет их расположение и субстратную специфичность. Уровень экспрессии каждого из циклинов и в меньшей степени сdk нацелено изменяется в определенные фазы клеточного цикла. Итак, выход клетки из состояния покоя G0 фаза и вход в фазу G1 определяется образованием комплексов циклинов D (D1-D3) с CDK4 или CDK6 (в соответствии от типа клеток). Переход из G1 фазы в фазу S связан с образованием комплексов циклина Е с CDK2 (Заридзе с соавт., 2004).

Рисунок 1. Общие принципы регуляции клеточного цикла в нормальной клетке

(Заридзе с соавт., 2004).

Помимо связывания с циклинами, активность сdk регулируется изменениями фосфорилирования их установленных аминокислотных остатков и связыванием с ингибиторами сdk (Заридзе с соавт., 2004). В Таблице 1 представлены основные циклин/ циклин-зависимый киназный комплексы позвоночных, специфичные для той или иной фазы (Мушкамбаров, 2007).

Таблица 1

Регуляция клеточного цикла

G1 период Циклин D/CDK4/6

переход из G1 в S период Циклин E/CDK2

S период Циклин A/CDK2

переход из S в G2 период Циклин А/CDK1

переход из G2 периода в митоз (М период) Циклин B/CDK1

Циклин H + CDK7 необходим для фосфорилирования и активациии

Циклин B/CDK1 + Циклин D/CDK4

Нарушения клеточного цикла приводят к генетической нестабильности, которая способствует развитию онкологической болезни. При раке генетический контроль деления клеток изменяется, что приводит к массивной клеточной пролиферации (рис.2). Мутации в основном происходят в двух классах генов: протоонкогены и гены-супрессоры опухолей. В нормальных клетках протоонкогены действуют на разных уровнях, тем самым стимулируя правильную пролиферацию клеток, тогда как мутантные протоонкогены или онкогены могут способствовать росту опухоли из-за неконтролируемой клеточной пролиферации. Опухолевые гены-супрессоры обычно уменьшают число клеток, либо путем остановки клеточного цикла и тем самым предотвращения клеточного деления, либо путем стимулирования запрограммированной гибели клеток. Когда эти гены оказываются нефункциональными посредством мутации, клетка становится злокачественной. Дефектные протоонкогены и гены-супрессоры опухолей действуют аналогично на физиологическом уровне: они способствуют возникновению рака за счет увеличения количества опухолевых клеток и стимуляции клеточного деления или ингибирования клеточной смерти или остановки клеточного цикла (Carrassa L., 2013).

Гены - супрессоры опухоли кодируют белки, которые обычно препятствуют образованию опухолей. Их нормальная функция заключается в подавлении злокачественной пролиферации клеток, или в запрограммированной остановке клеточного цикла. Мутации в генах- супрессорах опухолевого роста способствуют развитию рака за счет инактивации их функций. Когда клетка содержит одну функциональную аллель гена-онкосупрессора (образует достаточное количество белка для контроля клеточной пролиферации), то ген может ингибировать образование опухолей. Инактивация обоих аллелей гена-супрессора опухолевого роста приводит к нарушению функций и злокачественной пролиферации клетки.

Таким образом, инактивация генов-онкосупрессоров играет важную роль в развитии рака (Kumar V., 2005).

Рисунок 2. Генетическая регуляция клеточного цикла (Копнин, 2000).

Понимание молекулярных механизмов, которые участвуют в регуляции нормального прохождения клеточного цикла и контрольно-пропускных пунктов, а также их функциональное изменение в злокачественных клетках может иметь решающее значение для более точного определения событий, лежащих в основе такого сложного и многофакторного заболевания, как рак (Roessner, 2010; Vermeulen и др., 2003; Aarts и др 2013;. Kastan, 2004).

1.1. Структура и локализация генов р21, СDK2, CDK4, RB1, ING1, Myc-L

1.1.1. Структура и локализация гена СDK2

Ген циклинзависимой кинзы 2, cyclin-dependent kinase 2 (СDK2), расположен на длинном плече 12 хромосомы, (рис.3), содержит 7 экзонов (рис.4). Циклин E-Cdk2, и клетка совершает фазовый переход G1/S, что сопутствует индукции клеточной пролиферации. Данный ген состоит из 6016 пар оснований.

Рисунок 3. Схематическое изображение локализации гена СDK2 на хромосоме (www.genecards.org).

Хромосома 12 - NC_000012.12

Рисунок 4. Схематическое изображение структуры гена СDK2 (www.ncbi.nlm.nih.gov).

1.1.2. Структура и локализация гена СDK4

Ген циклинзависимой кинзы 4, cyclin-dependent kinase 4 (СDK4), локализован на длинном плече 12 хромосомы, экспрессируется в G1 периоде. Он охватывает 4,16 тыс. пар оснований геномной ДНК (рис.5), в направлении от теломеры к центромере, состоит из 8 экзонов, первый из которых приходится некодирующим, а стартовый кодон располагается в начале 2 экзона и стоп-кодон в начале 8 экзона (рис.6).

Рисунок 5. Схематическое изображение локализации гена СDK4 на хромосоме(www.genecards.org).

Хромосома 12 - NC_000012.12

Рисунок 6. Схематическое изображение структуры гена СDK4 (www.ncbi.nlm.nih.gov).

1.1.3. Структура и локализация гена RB1

Ген RB1, или ген ретинобластомы локализован на длинном плече 13 хромосомы (с 48,303,747 п.о. по 48,481,890 п.о.) в положении 34.2 (рис.7). Регуляция экспрессии осуществляется в переходе с G1 в S период. Размер данного гена достигает 178 kb геномной ДНК. Состоит ген из 28 экзонов (рис.9).

Рисунок 7. Схематическое изображение локализации гена RB1 на хромосоме (www.genecards.org).

Хромосома 13 - NC_000013.11

Рисунок 8. Схематическое изображение структуры гена RB1 (www.ncbi.nlm.nih.gov).

1.1.4. Структура и локализация гена ING1

Ген ING1, известный так же как ген ингибитор опухолевого роста локализован на хромосоме 13 в локусе 13q34, находящийся близко к теломерной области (рис.9). Ген ING1 состоит из четырех экзонов: экзона la, lb, 1с и 2 (рис.10), которые в результате сплайсинга приводят к пяти транскрибированным вариантам (INGla, ING lb, INGlc и ING Id).

Рисунок 9. Схематическое изображение локализации гена ING1 на хромосоме (www.genecards.org).

Хромосома 13 - NC_000013.11

Рисунок 10. Схематическое изображение структуры гена ING1 (www.ncbi.nlm.nih.gov).

1.1.5. Структура и локализация гена Myc-L

Ген Myc-L, или протоонкогенный белок Myc локализован на коротком плече 1 хромосомы (с 39,895424 по 39, 902256 п.о.) в положении 34.2 (рис.11). Активация экспрессии гена Myc-L необходима для вхождения клетки в S-фазу клеточного цикла (G1/S переход). Размер данного гена достигает 6,833 kb геномной ДНК. Ген состоит из девяти экзонов (рис.12). Продуктом гена Myc-L является белок с молекулярной массой в 40327 Da, который состоит из 364 аминокислот.

Рисунок 11. Схематическое изображение локализации гена Myc-L на хромосоме (www.genecards.org).

Хромосома 1-NC_000001.11

Рисунок 12. Схематическое изображение структуры гена Myc-L (www.ncbi.nlm.nih.gov).

1.2. Полиморфизмы генов СDK2, CDK4, RB1, ING1, Myc-L

1.2.1. Полиморфный вариант гена CDK2

Ген СDK2 кодирует семейства серин/треонин протеинкиназы, участвующие в контроле клеточного цикла; данный ген имеет очень важное значение для мейоза, но он безразличен в интересах митоза. Фосфорилирует CTNNB1, USP37, р53 / TP53, NPM1, CDK7, RB1, BRCA2, MYC, NPAT, EZH2 (Gil-Mi Ryu et al., 2009). Генетический полиморфизм rs3087335 (А/С) первого экзона гена CDK2 приводит к замене тирозина на серин в 15 положении. Во время проведения анализа представленности точковых, или, как их еще именуют, SNP-мутаций (single nucleotide polymorphism), мутаций гена CDK2, представленных в базе данных «dbSNP» (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=3087335), депонированной в интегрированной базе данных «GeneBank», для вида Homo Sapience было установлено 182 записи о точковых мутациях, некоторые части из которых являлись дублирующими. При анализе этих записей было установлено, что ген CDK2 обладает 162 уникальными SNP-мутациями, которые условно можно поделить на три группы: миссенс-мутации, то есть мутации, способные оказать влияние на структуру продукта гена (21 мутация, включая 4 мутации, ведущие к появлению кодона-синонима); мутации, которые затрагивают промоторную область гена CDK2 (44 мутации) и мутации, локализованные в интронах гена (101 мутация).

1.2.2. Полиморфный вариант гена CDK4

Полиморфизм гена rs2072052 CDK4 обусловлен транзицией нуклеотида аденина на цитозин в 501 положении данного гена и захватывает промоторную область. Данный полиморфный вариант не приводит к изменению в аминокислотной последовательности белка.

Существуют данные об ассоциации изучаемого полиморфизма с развитием рака кожи - меланомы. Частота носителей генотипа *С/*С была достоверно выше у онкологических больных, в сравнении с группой контроля (Pjanova, 2007).

Имеются также литературные данные, о том, что данный генетический полиморфный вариант влияет на предрасположенность к раку мочевого пузыря (Yuanqing et.al., 2008). Так курящие люди с редкими гомозиготными генотипами *С/*С не показали значительно повышенного риска развития рака мочевого пузыря по сравнению с группой людей, которые не курят, с гомозиготными и гетерозиготными генотипами полиморфного варианта rs2072052 гена CDK4 (OR = 2,04, 95% CI, 1,00-4,13). При последующем анализе ген-генных взаимодействий генов циклин D1 (CCND1) и CDK4 в выборке некурящих людей, было выявлено что, данные сочетания были связаны с прогрессирующим повышением риска развития рака молочной железы ( р< 0,001).