«Сравнительный анализ генов оксигеназ бактерий»

Цель данной работы - выявление генетических особенностей штаммов - деструкторов хлорароматических производных родов Achromobacter,

Pseudomonas,Rhodococcus и Xantomonas для последующего применения в целях очистки окружающей среды

Задачи:

1) получить биомассу чистых культур микроорганизмов на минимальной среде с добавлением хлорароматических производных в качестве единственного источника углерода и энергии;

2) выделить препараты геномной ДНК из клеток изучаемых штаммов;

3) провести ПЦР-анализ генов оксигеназ с применением высокоспецифичных праймеров генов xylM, xylA и tbmD.

4) разработать материалы для применения данной выпускной квалификационной работы в программе курса биологии высшей школы.

Научная новизна. Получены новые данные об особенностях организации геномов вновь выделенных бактериальных деструкторов из промзоны г.Уфы Республики Башкортостан родов Achromobacter, Pseudomonas,Rhodococcus и Xantomonas.

Практическое значение исследования. Результаты изучения генов, контролирующих ферменты, катализирующие расщепление ароматического кольца, раскрывают генетическое разнообразие микроорганизмов и расширяют возможности рационального применения микробов в технологиях охраны окружающей среды нового поколения.

Апробация.

1. Стариков С.Н., Дмитриев М.Н., Саетова К.У. Изучение бактериальных генов, контролирующих конверсию ароматических загрязнителей // 21-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА» (17- 21 апреля) / Пущино. Сборник материалов, 2017 г. - С 43-44

2. Стариков С.Н., Дмитриев М.Н., Саетова К.У. Сравнительный анализ бактерий-деструкторов хлорароматических загрязнителей // Материалы докладов V Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным участием (25 марта 2017 г.) / г. Махачкала, Россия: ДГПУ, Планета - Д, 2017 г. - С 207-209

3. Дмитриев М.Н., Стариков С.Н., Маркушева Т.В. ПЦР-АНАЛИЗ гена xylM, кодирующего монооксигеназу // Материалы Всероссийской (с международным участием) студенческой научно- практической конференции «Наука 2020» (19 апреля 2017 г.) / Уфа. Изд-во БГПУ, 2017. - стр 175-178

4. Стариков С.Н., Якшидавлетова Л.И., Сагитова А.И., Дмитриев М.Н. ПЦР анализ штаммов - деструкторов хлорароматических производных // В книге Актуальные вопросы современного химического и биохимического материаловедения Материалы V Международной молодежной научно-практической школы конференции. Башкирский государственный университет; отв.ред.О.С.Куковинец.2018.С.264-267.

Выражаю искреннюю благодарность профессору Горбуновой Валентине Юрьевне за предоставленную возможность работать в данном научном направлении, профессору Маркушевой Татьяне Вячеславовне за помощь при выполнении дипломной работы. Также выражаю благодарность всем сотрудникам кафедры генетики.

Плазмиды представляют собой линейную или кольцевую ковалентно замкнутую молекулу ДНК, содержанию от 1500 до 40000 пар нуклеотидов. Плазмиды, детерминирующие процессы деградации ксенобиотиков, получили название Д-плазмид. Большинство из них найдено у бактерий рода Pseudomonas. Они способны контролировать деградацию таких соединений, как ксилол, толуол, нафталин, камфора, 2.4-Д и др. Локализация генов биодеградации в плазмидах дает возможность конструирования новых штаммов микроорганизмов, способных к деградации нескольких ксенобиотиков.

В зависимости от способности передаваться в процессе конъюгации из одной бактериальной клетки в другую выделяют конъюгативные и неконъюгативные плазмиды (Waters, 2001).

Для повышения способности микроорганизмов к биодеградации используют технологии рекомбинантных ДНК, традиционного мутагенеза и методов отбора.

Так, например, путем рекомбинации генов двух штаммов Pseudomonas был получен штамм, способный расти на 5 ароматических соединениях. Приспособление микроорганизмов к изменяющимся условиям среды включают разные процессы: горизонтальный перенос генов, дупликации, инверсии, инсерции и др (Раутин, 2002). Горизонтальный перенос генов является главным «инструментом» быстрого приобретения и возникновения новых генов, которые способны радикально изменить свойства клеток, расширить их адаптационный потенциал (Шестаков, 2003). Наибольшее количество переносов характерно для свободноживущих бактерий с широкими экологическими ареалами, наименьшее - у патогенных бактерий, живущих в узких эконишах (Марков, 2008).

Получение“незнакомых”генов может изменить направленность эволюции видов, сильно воздействовать на фенотип вида, на его возможность к приспособлению в экологическом сообществе. Отличающийся ген может дать начало новой популяции, которая может вытеснить предыдущий вид. Это явление, в котором организм передаёт ДНК иному организму, способствует стремительному увеличению процесса эволюции (Шестаков, 2003).

1.4 Генетические особенности микроорганизмов деструкторов

Основной группой микроорганизмов, разрушающих ксенобиотики, являются бактерии, разные штаммы которых способны расщеплять достаточно большое количество органических соединений.

Аэробные бактерии рода Pseudomonas — значимая в научном и практическом отношении гетерогенная группа микроорганизмов, которая широко населяет биосферу и принимает активное участие в процессах минерализации органических соединений, а также очистке окружающей среды от загрязнения. Бактерии рода Pseudomonas достаточно часто встречаются в окружающей среде. Обнаружить их можно в воздухе, грунте, морских и пресных водоемах, сточных водах иле, нефти и на газовых месторождениях. Бактерии этого рода широко используются в сельском хозяйстве, а также в качестве моделей для многих теоретических исследований.

Представители рода Rhodococcus широко распространены в природе и выделяются из водных ( грунтовых, поверхностных, сточных) и почвенных биотопов, связанных, в частности, с месторождениями нефти и газа ( Нестеренко, 1985). Обладая уникальными биологическими свойствами в том числе, широкими катаболическими возможностями и уникальными ферментными системами, родококки могут деградировать разнообразные по химической структуре ксенобиотики (Larkin, 2005). Эти особенности в сочетании со способностью выживать в неблагоприятных условиях среды делают представителей рода Rhodococcus перспективными при разработке биокатализаторов и биопрепаратов для ремидиации загрязненных углеводородами объектов окружающей среды. Биодеструктирующие свойства бактерий рода Rhodococcus ( взаимодействие с гидрофобными субстратами и окисление их широкого спектра) обусловлены наличием липофильной клеточной стенки, которая с одной стороны, обладает высоким сродством к углеводородам и обеспечивает взаимодействие с ними, а с другой, выполняет барьерную функцию для крупных молекул, в том числе антибиотиков ( Bell, 1998). Разнообразие катаболических путей, позволяющих родококкам метаболизировать широкий круг соединений, обусловлено большим размером их генома, который включает плазмиды - от маленьких кольцевых до больших линейных, на которых расположено большое число катаболических генов, а также генов устойчивости и вирулентности( Larkin, 2010). Для представителей рода Rhodococcus характерно наличие генных кластеров, включающих хромосомы и несколько плазмид или только плазмиды, между которыми рассредоточены гены деградации, что также является важным фактором катаболического разнообразия и универсальности ( Larkin, 2006).