«Определение эффективности различных способов получения безвирусного материала картофеля с помощью метода пцр»

На территории РФ получили повсеместное распространение многие вирусы, имеющие высокую степень вредоносности. Особого внимания из-за широты распространения и степени наносимого вреда, следует обратить на следующие вирусы: ВСЛК- вирус скручивания листьев , Y-вирус картофеля, SBK , МВК- и X вирусы картофеля. (Кеглер Х., Кляйнхемпель У., 1986) Данные вирусы способны поражать не только растения картофеля, но и томат, баклажан, перец сладкий и табак.

Основным и наиболее значимым переносчиком являются многочисленные виды тлей и цикадки. Все насекомые с грызущим ротовым аппаратом являются переносчиками заболеваний. Некоторые вирусы имеют возможность передаваться настоящими семенами и пыльцой. (Fernow et al., 1970)

Тяжесть инфекционного заболевания растения зависит от штамма возбудителя, природно-климатических условий и самого сорта картофеля. В комплексе вирусы приумножают свое губительное воздействие, что ведет к ухудшению вкусовых качеств, снижению урожайности и вирусному вырождению вегетативно размножаемых сортов.

В связи с этим постоянно возникает необходимость получения безвирусного посадочного материала. Для этого используют различные способы, такие как: метод апикальной меристемы, термотерапия,

химиотерапия, электротерапия, обработка РНКазой, обработка рибовирином, криотерапия и комплексная терапия, в которой комбинируются от двух до четырех перечисленных методов.

Кроме того, особое внимание следует уделять контролю за распространением опасных карантинных патогенов картофеля. Эффективность борьбы с инфекционными болезнями картофеля во многом зависит от их ранней диагностики. В связи с тем, что многие вирусы имеют тенденцию к переходу в скрытую форму, возникает проблема с их идентификацией с помощью индикаторного и иммуноферментного анализа, так как они не обладают достаточной точностью. Многие вирусы не могут быть идентифицированы индикаторным способом, если вирусы близкородственны, так же ИФА не может быть применен к вирусам которые лишены белка в составе вироида.

С целью обеспечения своевременной и точной диагностики фитопатогенов картофеля используется метод ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов (FLASH-ПЦР, ПЦР «в реальном времени»). Кроме того, полимеразная цепная реакция дает возможность проведения мультикомплексного анализа на несколько патогенов в одном образце, что значительно облегчает фитосанитарный анализ образцов и исключает дальнейшее культивирование зараженных растений. Применение таких диагностических наборов позволяет в течение нескольких часов получить надежные, быстрые и достоверные результаты (специфичность анализа составляет более 99%).

Актуальность: Картофель является неотъемлемой частью

продовольственных культур в России, но тем ни менее наблюдается низкий выход урожая из-за некачественного посадочного материала, который подвержен всевозможным вирусным, бактериальным и грибковым инфекциям. На сегодняшний день, актуальным является разработка наиболее эффективных методов оздоровления посадочного материала и его высокоточный анализ, с помощью метода ПЦР-РВ.

Цель данной работы заключалась в фитосанитарной оценке, проведенной антивирусной терапии методом RT-PCR для получения оздоровленных растений картофеля в условиях in vitro.

Задачи:

1. Оптимизировать процесс выделения нуклеиновых кислот из растительного материала;

2. Проведение реакции обратной транскрипции и последующей мультикомплексной ПЦР в реальном времени.

3. Измерение и интерпретация аналитического сигнала по трем каналам флуоресценции: FAM, ROX, HEX.

4. Оценка эффективности антивирусной терапии, проведенной с помощью метода апикальной меристемы и термообработки эксплантов.

5. Разработка рекомендации по применению теоретического и тактического материала, используемого в ВКР, в школьном курсе "Биология".

Научная новизна заключается в оценке комбинированного способа получения безвирусного материала картофеля и его количественная оценка методом ПЦР-РВ. Метод обладает высокой чувствительностью, что является необходимым для выявления зараженного материала, с целью повышения его продуктивности.

Научно-практическая значимость. В связи с отсутствием качественного оздоровленного материала, сельское хозяйство терпит значительные убытки. В настоящее время, бактериальные, вирусные и 7

грибковые инфекции с каждым годом все значительнее снижают урожайность. Основной задачей является разработка технологии элиминация вирусов. у высоко продуктивных сортов безвирусного материала и закрепление продуктивности сортов на длительный период времени.

Апробация. По материалам данной выпускной квалификационной работы подготовлена статья Абрамов С.Н., Галикеева Г.Ф., Губайдуллина Л.Д., Климина Е.В., Магасумова Ю.Р. Разработка технологии получения посадочного материала картофеля свободного от X и Y вирусов комбинированным способом// В международном научном журнале “Colloquim-journal” №14(38), 2019, индексируемом в РИНЦ.

Также материалы работы были представлены на конференции в международном журнале “Вестник Науки” Климина Е.В., Галикеева Г.Ф. Идентификация вирусов у растений картофеля методом полимеразной цепной реакции // В международном научном журнале “Вестник Науки” № 2 (11) т.3, г. Тольятти, от 17 февраля 2019 г.

Работа выполнена на кафедре генетики Башкирского государственного педагогического университета им. М. Акмуллы. Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю Галиеевой Г.Ф. за оказание практической помощи при выполнении выпускной квалификационной работы, а также профессору Горбуновой Валентине Юрьевне за предоставленную мне возможность работать в данном научном направлении.

Картофельное растение может быть заражено одним или чаще несколькими вирусами. При совместном заражении степень угнетения растения и потери урожая увеличиваются в два-три раза, что является основной причиной снижения продуктивности. Вырождение может быть следствием неблагоприятных условий произрастания и нарушения питания растений (высокая температура - выше 25 ° С, недостаток влаги в почве в период клубнеобразования).

По мнению А.Г.Зыкина (1976), по степени вредоносности на территории РФ наиболее распространенные возбудители вирусных и микоплазменных болезней располагаются в следующем порядке: вирусы Y, Х, S, М, А, вироид веретеновидности, вирус скручивания листьев (ВСЛК) и микоплазма - возбудитель столбура.

По данным немецких исследователей (Кеглер Х., Кляйнхемпель У., 1986) отмечается, что среди примерно 20 вирусов, встречающихся на картофеле, особого внимания из-за вредоносности и широты распространения заслуживают следующие: вирус скручивания листьев картофеля (ВСЛК), Y-вирус картофеля, S- и М вирусы картофеля.

На основе обобщения современных литературных источников о наиболее характерных особенностях, вредоносности и распространении, наиболее вредоносными вирусами картофеля и широко распространенные на территории Республики Башкортостан , являются вирусы: Y, X, M, S, L и ВВКК (Yang, X., 1991)

1.1.1. Характеристика Х - вируса картофеля - ХВК

ХВК - типичный представитель группы потивирусов, представляет собой нитевидные частицы 515*13 нм со спиральной основой. Известны многочисленные штаммы вируса Х, которые значительно изменяются по патогенности (Сухов К.С., 1977).

Х - вирус способен вызвать такие заболевания как: межжилковая мозаика, крапчатость, верхушечный некроз, обыкновенная мозаика картофеля (рис.1). Х вирус распространен по всему свету, присутствует везде, где выращивают картофель.

Рис.1. Здоровый и пораженный листы картофеля (Симаков Е.А., 2005): а - лист здорового растения картофеля; б - лист картофеля, пораженный обыкновенной мозаикой

Вирус передается контактно через ранки, может передаваться почвообразующими грибами и насекомыми с грызущим ротовым аппаратом.

Некоторые некротические штаммы могут вызвать у ряда сортов картофеля потери более чем 50 %. В сочетании с другими вирусами

картофеля, гораздо более вредоносен, и вследствие этого является потенциально опасным.

Несколько лет назад было показано, что субъединицы белка оболочки ХВК в составе вириона могут находиться в двух разных функциональных состояниях «покоящемся» (когда внутривирусная РНК не способна к трансляции) и «активированном» (когда РНК приобретает способность к трансляции in vivo и in vitro после взаимодействия 5'-конца вириона с вирус- специфическим белком ТБ1). Переход вириона в активированное состояние («ремоделирование») сопровождается дестабилизацией всей вирусной частицы (Rodionova et al, 2003).

Молекула БО ХВК русского штамма ХВК (длиной 236 аминокислотных остатков) содержит пять остатков триптофана и два остатка тирозина (Морозов и др , 1983) и поэтому является удобным объектом для изучения методами собственной флуоресценции и ближней КД- спектроскопии.

Вторичная структура белка сохраняет высокую стабильность и после освобождения из вирионов а-спиральные участки БО ХВК не разрушаются даже высокими концентрациями детергентов. Такое сочетание лабильной укладки и стабильной вторичной структуры, вполне может являться структурным основанием способности этого белка находиться в составе вирионов в двух разных состояниях.

Модель субъединицы БО ХВК in situ состоит из двух отдельных доменов - типичного пучка из четырех сс-спиралей и РНП-фолда с присоединенной сбоку Pa-единицей. Данная модель лучше объясняет высокую лабильность третичной структуры свободного БО ХВК и структурные превращения, претерпеваемые этим белком в составе вириона.